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    细胞生物学Cell Biology

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    各类western转膜条件

    丁香園上一篇好文章!

    除了抗體原因,轉膜恐怕是western blot成敗的最關鍵因素。 


    蛋白來源:RAW264.7 總蛋白

    蛋白名稱(可保密):一些轉錄因子
    蛋白分子量:40~70 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.45 NC
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流400 mA
    轉膜時間:60~90 min
    PS.其實吧,以我的經驗來看,除非目的蛋白特別小,或者特別大,不然轉膜時間真的不是那么重要, 曾經因為失誤,轉了15 min就拆下來了,但從麗春紅染色來看,跟平常實驗也沒有太大的區別。

    蛋白來源:內皮細胞 總蛋白
    蛋白名稱(可保密):occludin & AKT
    蛋白分子量:65 KD & 56 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.45 PVDF
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓 100 V
    轉膜時間:60~70 min
    設備名字是“Bio-Rad mini”。

    蛋白來源:乳鼠心肌細胞和成年鼠心肌組織 總蛋白和核蛋白
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:65 KD & 55 KD
    WB用膜類型、孔徑:PVDF(預先用甲醇處理)
    轉膜方式(恒壓、恒流):半干轉 恒壓 12 V
    轉膜時間:30-40 min
    設備:“Bio-Rad mini”
    建議:最開始做過濕轉(過夜的那種),太費事費時,效果也不如半干轉。

    蛋白來源:293T細胞
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:95 KD & 35 KD
    WB用膜類型、孔徑:PVDF
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓 90 V-110 V,控制電流不要超過300 mA。
    轉膜時間:70 min

    蛋白來源:腫瘤手術標本
    蛋白名稱(可保密):轉錄因子
    蛋白分子量:33 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):350 mA 恒流
    轉膜時間:150 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
    說明:相同條件曾用于數個30-70 KDa的蛋白,都能成功轉上,不過沒有試縮短時間效果如何; 實驗時沒為轉膜條件苦惱,倒是電泳時膠的濃度及時間根據不同分子量而有區別。

    蛋白來源:成纖維細胞
    蛋白名稱(可保密):smad3
    蛋白分子量:54 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):350 mA 恒流
    轉膜時間:150 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad

    蛋白來源:胰腺癌細胞
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:16 KDa and 42 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):120 V 恒壓
    轉膜時間:90 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad


    蛋白來源:大鼠血管平滑肌細胞
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:72 KD,42 KD 和22 KD
    WB用膜類型、孔徑:一般的PVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉,恒流一張膜0.26 A,兩張膜0.3 A。
    轉膜時間:90 min
    設備:“Bio-Rad mini”
    建議:轉膜緩沖液最多用3次,最好現用現配,我們用的沒有加SDS,轉的時候最好能用冰塊一類的東西降一下溫,這樣轉的效果要好一些,轉的時候一定要把三明治每層之間的氣泡除去,同時使濾紙大于膜,膜大于膠,以免燒壞電極。

    蛋白來源:大鼠PBMC
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:55 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.22的PVDF膜
    轉膜方式(恒流):濕轉
    轉膜時間:60-90 min
    設備:“Bio-Rad mini”
    建議:轉膜液用過兩三次之后轉膜效果就很差了 其它按照常規就好了  其實0.22的膜一般不怕轉過頭 以我們的經驗,轉膜時間、電壓其實 也有很大范圍的調整 ,并不是非要固定于哪一個最合適,曾經做過  一張膜轉,17 KD的和170 KD的,按照170 KD的條件,17 KD的轉膜也很好的。

    蛋白來源:人非小細胞肺癌細胞系
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:大于250 kD
    WB用膜類型、孔徑:millipore PVDF膜 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉,恒流0.3A。
    轉膜時間:180min
    設備:“Bio-Rad ”
    建議:電轉保持電壓在70 V以上,保持低溫,如果電壓低過70就需要換緩沖液了。


    蛋白來源:白血病細胞
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:28 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.45的NC膜
    轉膜方式(恒流):濕轉,90 min,0.25 A
    設備:“Bio-Rad ”
    建議:海綿厚度要合適,一次轉磨用的海綿太薄,導致三明治沒夾緊,轉膜后拿出來一看,marker都變得七扭八歪。但是有前輩說墊的海綿太厚可能將膠壓斷,沒經歷過,不知道是不是會有這種情況。

    蛋白來源:腫瘤細胞
    蛋白名稱(可保密):磷酸化蛋白
    蛋白分子量:10-200 KDa
    WB用膜類型、孔徑:millipore PVDF膜 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):120 v 恒壓
    轉膜時間:120 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
    建議:轉膜緩沖液只用2次,基本都轉上,5%BSA封閉,減少背景。
     
    蛋白來源:胰腺β細胞
    蛋白名稱(可保密):******
    蛋白分子量:90-130 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):250 mA 恒流
    轉膜時間:150 min
    轉膜設備:濕轉
     
    蛋白來源:原核表達
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:38 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.45 NC
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓:100 V
    轉膜時間:120 min
     
    蛋白來源:心臟
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:220 kDa,130 kDa,70 kDa,41kDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓
    轉膜時間:70 v120 min,180 min,5-6 h
    轉膜設備:伯樂濕轉
    建議改進方向(可選):40 kDa一下,70 v ,60-90 min足夠,40-70 kDa 90-120 min即可。
    70-120 kDa ,70 v,120-180 min足夠,120-180 kDa ,180-240 min,180 kDa以上建議6 h。
     
    蛋白來源:卵巢癌細胞膜蛋白
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:53 KD
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓
    轉膜時間:80 V 100 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
     
    蛋白來源:人宮頸癌HELA細胞總蛋白
    蛋白名稱(可保密):β-actin
    蛋白分子量:42
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓
    轉膜時間:50 4 h
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad

     
    蛋白來源:腦組織
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:16 KD、27 KD、32 KD、42 KD
    WB用膜類型、孔徑:PVDF 0.22 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):半干轉 恒流 1 mA/cm2或2 mA/cm2
    轉膜時間:不定
    轉膜設備:北京六一儀器
    建議:我共做了六個蛋白,所以總在想節約時間的方式。
    在預試時我會觀察電壓數與轉膜效率的關系,所以我不會按時間來定何時轉完,而是按電壓來定。通過染膠來確定電壓數與轉移蛋白分子量上限的關系。這樣有的5分鐘就轉完了,不用多浪費時間。并且六一的半干轉膜儀隨著使用次數的增多,效率也會下降,所以時間和轉膜效率(尤其是使用后期)的關系并不穩定,單純依靠時間有時會有問題。
     
    蛋白來源:CHO cell
    蛋白名稱(可保密):酶原
    蛋白分子量:40 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.22的PVDF膜(Biorad)
    轉膜方式(恒壓):100 V,濕轉,轉膜時間:60 min。
    設備:Tanon(上海天能)
    建議:
    1.  轉膜液現用現配,用完倒掉。
    2.  轉膜時間,電壓可以適當調整。分子量大或者小一些的蛋白,采用此條件一樣轉膜效率很高。
     
    蛋白來源:Hepg2
    蛋白名稱(可保密):EGFR
    蛋白分子量:170kd
    WB用膜類型、孔徑:pvdf 0.45
    轉膜方式(恒壓、恒流):24V
    轉膜時間:2個半小時
    轉膜設備:伯樂半干轉

     
    蛋白來源:肝癌細胞
    蛋白名稱:HIF-1α
    蛋白分子量:120 kD
    WB用膜類型、孔徑:NC膜
    轉膜方式(恒壓):80伏,濕轉
    轉膜時間:150分鐘
    設備:“Bio-Rad mini”
    建議:濕轉,轉膜液特別重要,否則會導致電壓或者電流不穩影響轉膜條帶。轉膜均現配先用,不重復利用。轉膜時間一般是150分鐘,80伏恒壓。經李春紅染色,靠近蛋白膠的一側膜上蛋白染色深,膜另外一面染色淺,說明蛋白未轉過。該濕轉條件自己做過的蛋白分子量范圍:170-36 kD。
     
    蛋白來源:心肌細胞總和膜
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:128 KD,100,60,55,43 KD
    WB用膜類型、孔徑:NC膜 0.2 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓
    轉膜時間:70 V 200 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad

    建議:轉膜液最好現配現現用,或配成母液,最好不重復使用,70 V電壓下,電流約154 mA。甲醇可以加到150 ml。對大分子量如200 KD轉膜時間延長6-8 h。


    蛋白來源:肺臟

    蛋白名稱(可保密):ICAM-1
    蛋白分子量:85~110 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.22NC
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 300 mA
    轉膜時間:120 min
    設備名字 Bio-Rad mini
    一抗用的santa cruz 1 mL包裝的。 比例調整到1:800做出很好的條帶。 效價會一直降低的。去年做的這個指標,今年夏天做就不行了。
     
    蛋白來源:成纖維細胞
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:16 KDa
    WB用膜類型、孔徑:0.2 um PVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):0.2 A恒流
    轉膜時間:65 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
     
    蛋白來源:成纖維細胞
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:28 KDa
    WB用膜類型、孔徑:0.2 umPVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):0.25 A恒流
    轉膜時間:60 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
     
    蛋白來源:人腫瘤細胞
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:80 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.45 um PVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):半干轉移系統恒流,勿超過0.85 mA/cm2,同時轉多張膜電流需累加(串聯)
    轉膜時間:60-90 min
    設備:Bio-Rad
    其實有些東西并不是非常嚴格的,要轉移的目的蛋白分子量小,那么轉移的時間就短一些,反之,則長一點;蛋白量充足,可以多轉一會,蛋白量較少,則要少轉一下,免得蛋白穿膜而過到了濾紙上而前功盡棄。
     
    蛋白來源:人和鼠肝癌細胞總蛋白、胞漿、胞核蛋白
    蛋白名稱(可保密):***
    蛋白分子量:17--116 kd
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流 200 mA
    轉膜時間:3 h
    轉膜設備:濕轉 北京六一 24D mini
     
    蛋白來源:CO COS7 293T
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:80 72 56 52 48 25 18KD
    WB用膜類型、孔徑:0.45 um PVDF膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 90 V 電流約為230--280 mA之間。兩張膜串聯疊加。
    轉膜時間:40 min
    設備:Bio-Rad 法碼西亞
     
    蛋白來源:人腫瘤細胞
    蛋白名稱(可保密):磷酸化蛋白
    蛋白分子量:30-60 KDa
    WB用膜類型、孔徑:pall NC膜 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜
    轉膜時間:60-90 min
    轉膜設備: 北京六一 半干轉
    建議:轉膜緩沖液用新鮮配制的,可先配成2倍的母液,轉膜液的多少會影響電轉的效率,一般將吸水紙潤濕即可,不要和膜一起浸泡,這樣效果很好。
     
    蛋白來源:人肝癌腫瘤細胞
    蛋白名稱(可保密):notch
    蛋白分子量:60-120 KDa
    WB用膜類型、孔徑:pall NC膜 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流 0.3 A
    轉膜時間:-20度冰柜120 min
    轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad
    建議:轉膜緩沖液用新鮮配制的,可先配成10倍或5倍的母液,保持低溫是轉膜效果的一個保證,這樣效果很好。
     
    蛋白來源:膠質瘤細胞總蛋白和核蛋白
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:18 KDa 、36 KDa、55 KDa、98 KDa
    WB用膜類型、孔徑:NC膜 PALL
    轉膜方式(恒壓、恒流):0.35 恒流
    轉膜時間:60 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad mini
    轉緩液的配制有點講究。如果蛋白大于一百多,一般加入SDS,時間延長結果會更好些。
    由于,目前試驗的蛋白就都不大,所以,我們都采用不加SDS的轉緩液,跑出來的條帶也很整齊、干凈。
     
    蛋白來源大腸癌205
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:92 kd,43 kd
    WB用膜類型、孔徑:0.45pvdf
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓
    轉膜時間:90 min
    轉膜設備:濕轉,天能。
     
    蛋白來源:大鼠腦組織
    蛋白名稱(可保密):BDNF(28 KDa)、Bactin(42 KDa)、LaminB(72 KDa),以及磷酸化蛋白(保密 43 KDa)
    WB用膜類型、孔徑:PVDF(0.45)膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):300 mA 恒流
    轉膜時間:60 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad Mini
    轉膜緩沖液:25%甲醛 覺得這個濃度的甲醛可以有效降低電轉的熱量,而且使膜對蛋白的吸附效果較好,Marker轉到膜上很鮮艷。 用立春紅染色效果也很好。

     
    蛋白來源:表達產物
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:29 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF
    轉膜方式(恒壓、恒流):0.3 A 恒流
    轉膜時間:80 min
    轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad
     
    蛋白來源:cell lysate, culture medium
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:15-50 kD
    WB用膜類型、孔徑:NC,PVDF, 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓, semi-dry
    轉膜時間:about 2h is ok if the protein is small and the voltage can keep 100 V, if not increase to 3-4 h。
    轉膜設備: Bio-Rad
     
    蛋白來源:肺臟、肝臟等。
    蛋白名稱(可保密):actin
    蛋白分子量:43 kD
    WB用膜類型、孔徑:NC膜PALL 0.22 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 200 mA
    轉膜時間:45~60 min
    設備名字 Bio-Rad mini
    用的santa cruz 分裝和整裝的都可以。效價一般1:1000-1:3000左右,可穩定較長一段時間。
     
    蛋白來源肺臟
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:19 kd,35 kd
    WB用膜類型、孔徑:0.2pvdf
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流250
    轉膜時間:150 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad mini
     
    蛋白來源:大鼠血管
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:140 kd
    WB用膜類型、孔徑:0.45pvdf
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流,200 mA
    轉膜時間:210 min
    轉膜設備:濕轉,北京六一
     
    蛋白來源:心肌
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:90 kDa,70 kDa,12.6 kDa
    WB用膜類型、孔徑:NC
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓
    轉膜時間:70 v 240 min,120 min,60 min
    轉膜設備:伯樂濕轉

    蛋白來源:腦
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:16 KD 60 KD
    WB用膜類型、孔徑:16的用0.22的PVDF,60的用0.45的NC
    轉膜方式(恒壓、恒流):20 V
    轉膜時間:16的30 min,60的90 min
    轉膜設備:Bio-Rad 半干
     
    蛋白來源:子宮內膜癌組織
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:156.8
    WB用膜類型、孔徑:NC膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流400mA
    轉膜時間:90 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
     
    蛋白來源:真核表達
    蛋白名稱(可保密):(多種,30個以上)
    蛋白分子量:40-200 kD
    WB用膜類型、孔徑:PVDF
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓100 V(電流在280 mA至350 mA之間)
    轉膜時間:60 min(M<100kD),60-100min (100kD<M<200kD)
    轉膜設備:濕轉
     
    蛋白來源:大鼠腎臟
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:130 kD
    WB用膜類型、孔徑:0.45NC膜 PALL
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 350 mA
    轉膜時間:120min
    設備名字 Bio-Rad mini
    一抗用的sigma 羊抗大鼠,0.2 mL包裝的,打折后價格3000多,有些貴哦。
    比例調整到1:1500左右條帶可,用BSA封閉。但是背景稍高。
     
    蛋白來源:腦組織
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:38 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜,
    轉膜方式(恒壓、恒流):80 v恒壓
    轉膜時間:180 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad mini

     
    蛋白來源:真核表達
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:約35 kD(雙亞基)
    WB用膜類型、孔徑:0.22 um PVDF
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流200 mA
    轉膜時間:60 min
    轉膜設備:濕轉Bio-rad,天能,六一
    轉膜時間其實不需要那么長的,轉膜沒轉上一般原因不在這里,可能是轉膜液的原因:有些蛋白SDS可能影響其與膜的結合,還原型電泳因巰基乙醇的原因也可能導致后面的抗體不結合(這是我最近的經驗教訓),還有一抗的選擇很重要,一定要選識別線性表位的抗體,才能用于做WB。
     
    蛋白來源:細菌蛋白
    蛋白名稱(可保密):全部的可溶性蛋白
    蛋白分子量:11-170 KD
    WB用膜類型、孔徑:0.45 NC
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流300 mA
    轉膜時間:80 min
     
    蛋白來源: 骨肉瘤細胞
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量: 72 kDa
    WB用膜類型、孔徑: PVDF膜(0.45 um)
    轉膜方式(恒壓、恒流): 半干轉 恒流200 mA
    轉膜時間: 20-30 min
    轉膜設備:Bio-Rad 型號忘了,就是有4個插孔的電泳儀。
    建議改進方向:低溫很重要,新鮮的電轉液也很重要。


    蛋白來源:骨肉瘤CELL LINE

    蛋白名稱(可保密):Beta actin
    蛋白分子量:42 kDa
    WB用膜類型、孔徑:Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉,恒壓22 v
    轉膜時間:90 min
    轉膜設備:X-cell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen)
    建議改進方向:轉膜過程冰水浴,保持低溫,Transfer Buffer重復使用。

     
    蛋白來源:腎瘤細胞
    蛋白分子量:39 kDa
    WB用膜類型、孔徑:Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓100 v
    轉膜時間:50 min
     
    蛋白來源:MCF7
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:70 kDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜(GE)
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 100伏
    轉膜時間:60 min
    轉膜設備:伯樂小轉膜儀
     
    蛋白來源:pichia 分泌表達
    蛋白名稱(可保密):細胞因子等
    蛋白分子量:17到30 kDa
    WB用膜類型、孔徑:millipore PVDF 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓:100 V
    轉膜時間:60 min
    這個條件除了100 KDa的預染maker轉的不好,剩下的條帶都非常清晰。正向前面ycwzq說的,感覺時間不是很重要,只要蛋白別太小或太大,在一個比較寬的時間和電壓范圍都能轉上。當然這些還有一個重要的影響因素就是所用的蛋白轉印緩沖液。
     
    所以建議把自己用的轉印緩沖液的配方也貼上,便于分析交流。
    我先說我的吧,是大師兄師姐的配方,我用了感覺還不錯,但是100 KDa以上的轉的不好。
    蛋白轉印緩沖液pH8.2:Tris堿1.93 g,甘氨酸9 g,甲醇200 ml,加水定容至1000 ml。
     
    蛋白來源: 大鼠坐骨神經
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量: 30 kDa
    WB用膜類型、孔徑: PVDF膜(0.2 um)
    轉膜方式(恒壓、恒流): 濕轉 恒流300 mA
    轉膜時間: 45 min
    轉膜設備: Bio-Rad
     
    蛋白來源:小鼠胚胎成纖維
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:36 KDa、55 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.45
    轉膜方式(恒壓、恒流):0.3 A 恒流
    轉膜時間:60 min
    轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad mini
    墊子變薄時,可用三層纖維墊,也沒問題。
     
    蛋白來源:小鼠前列腺癌細胞
    蛋白名稱(可保密):P53 P21 RAD51 GAPDH
    蛋白分子量:53 KDa、21 KDa、37 KDa、36 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.45
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓110 v
    轉膜時間:60 min
    轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad mini
     
    蛋白來源:HEK293總蛋白
    蛋白名稱(可保密):***
    蛋白分子量:~200KD
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.2 um (用甲醇預先處理)
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓 25 V
    轉膜時間:過夜 (~16-20 hours)
    轉膜設備:biorad mini
     
    蛋白來源:人前列腺癌細胞
    蛋白名稱(可保密):***
    蛋白分子量:~40 KD
    WB 用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.45 um (用甲醇預先處理)
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓 20 V, 限制最高電流0.3 A。
    轉膜時間:過夜 (~16-20hours)
    轉膜設備:biorad semi-dry
     
    蛋白來源:組織
    蛋白名稱(可保密)
    蛋白分子量:42 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜(0.22)
    轉膜方式(恒壓、恒流):350 mA 恒流
    轉膜時間:60-90 min
    轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
     
    蛋白來源:E.Coli BL21
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:4 kd
    WB用膜類型、孔徑:PVDF 0.22 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓15 v
    轉膜時間:O/N
    轉膜設備: Bio-Rad Mini 濕轉
    轉膜液的配制:for 1 L transfer buffer, 200 ml Methanol,14.4 g Glycine,3.03 g Trizma-base。
    用了Trcine-gel SDS Page,效果不錯
     
    蛋白來源:腎臟
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:23 kd
    WB用膜類型、孔徑:PVDF 0.45 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓20 v
    轉膜時間:35 mins
    轉膜設備: Bio-Rad 半干
     
    蛋白來源: 來自MDCK增殖的流感病毒裂解物
    蛋白名稱(可保密):PB1
    蛋白分子量: 96 kd (注意,10% SDS-PAGE,冰上電泳。用預染marker觀察100kd的條帶跑到膠的正中間位置時,才開始轉膜,否則轉膜效率降低)
    WB用膜類型、孔徑: NC膜, 0.45
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓,100V
    轉膜時間: 2 hours
    轉膜設備: BIO-rad 轉膜設備。其間,準備一個冰盒,將電泳槽半埋到冰里。
    轉膜液的配制:(如甲醇的比例和是否加SDS以及多大質量濃度等): 2.9 g甘氨酸,5.8 g tris,0.37 g SDS,200 ml甲醇。
     
    蛋白來源:腎臟
    蛋白名稱(可保密):
    蛋白分子量:9 kd
    WB用膜類型、孔徑:PVDF 0.22 um
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓20 v
    轉膜時間:30 min
    轉膜設備: Bio-Rad 半干
     
    蛋白來源: 軟骨細胞
    蛋白名稱(可保密):b-actin
    蛋白分子量: 43 kd
    WB用膜類型、孔徑: PVDF膜, 0.45
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉,恒流,350 mA
    轉膜時間: 85 min
    轉膜設備: BIO-rad 轉膜設備。其間,準備一個冰盒,將電泳槽半埋到冰里。
    轉膜液的配制:(2.92 g甘氨酸,5.8 g tris,0.375 g SDS,200 ml甲醇,用雙蒸水定容到1 L)
     
    蛋白來源:宮頸癌細胞
    蛋白名稱:保密
    蛋白分子量:60 kD
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.45 uM
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流,按膜的面積來算電流,標準大小的膜-60 mA/張
    (8.2 cm x 6.0 cm)
    轉膜時間:2 h
    轉膜設備:Biorad semi-dry
    轉膜液的配制:Boston Bioproduct Transfer buffer +10-20% 甲醇
    建議改進方向:
    做半干轉的時候,三明治上面再壓一張濾紙,可以保證壓緊,轉膜效率穩定。用這個條件做過不少不同分子量的蛋白,最小從15 kD,到最大235 kD,都可以得到穩定結果。轉膜液只用一次,不重復使用。
     
    蛋白來源:家牛肝細胞
    蛋白名稱(可保密):保密
    蛋白分子量:30 kDa
    WB用膜類型、孔徑:NC, 6x8 cm, 0.45 um
    轉膜設備:Invitrogen 濕轉,外層冰水浴冷卻。
    轉膜方式(恒壓、恒流):恒流170 mA
    轉膜時間:根據膠的厚度而定,每0.5 mm轉30 min, 1.5 mm的超厚預制膠轉1.5-2 h。
    轉膜液的配制:10 mM碳酸氫鈉,3 mM碳酸鈉,20%甲醇。
    建議改進方向:已考染的膠脫色后可以用此法轉膜,條帶稍淡但不影響結果。

     
    蛋白來源:組織
    蛋白名稱(可保密)
    蛋白分子量:170 KDa
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜(0.45)
    轉膜方式(恒壓、恒流):300 mA 恒流
    轉膜時間:170 min
    轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad
     
    蛋白來源:HepG2細胞
    蛋白名稱(可保密):Akt及P-Akt
    蛋白分子量:55KDa/56KD
    WB用膜類型、孔徑:PVDF膜 0.45孔徑
    轉膜方式(恒壓、恒流):100V 恒壓
    轉膜時間:75 min
    轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad

     
    蛋白來源:大鼠
    蛋白名稱(可保密):Bactin(42 KDa)
    WB用膜類型、孔徑:PVDF(0.45)膜
    轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流150 mA
    轉膜時間:100 min
    轉膜設備: 北京六一
     
    蛋白來源: 大鼠大腦皮質
    蛋白名稱(可保密):b-actin
    蛋白分子量: 43 kd
    WB用膜類型、孔徑: PVDF膜, 0.45
    轉膜方式(恒壓、恒流):半干轉,恒流,2 mA/cm2
    轉膜時間: 8-55 min
    轉膜設備: BIO-rad 轉膜設備。
    轉膜液的配制:(2.92 g甘氨酸,5.8 g tris,0.375 gSDS,200 ml甲醇,用雙蒸水定容到1 L)

     

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