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        分子生物学Molecule Biology

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        X-Gal的作用机理及IPTG-X-gal平板制作方法
        一、簡介

        X-Gal在β-半乳糖苷酶的催化下水解后呈藍色,因此常用于轉基因篩選試驗中,如藍白斑篩選或β-半乳糖苷酶的原位染色檢測實驗。藍白斑試驗中主要根據菌落呈現的顏色即可簡單的挑選出哪些是轉化子。

        分子式為C14H15BrClNO6,分子量為408.63,CAS Number 7240-90-6。

        X–Gal是β–半乳糖苷酶(β–galactosidase)的底物,水解后呈藍色?;谶@個特點,pUC系列載體DNA(或其他帶有lacZ 基因載體DNA)以lacZ 缺失細胞為宿主進行轉化時、或用M13噬菌體載體DNA進行轉染時,如果在平板培養基中加入X–Gal和IPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互補性,可以根據是否呈現白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑選出基因重組體。

        二、使用方法 :

        首先把X-Gal配制成20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(-20℃避光保存),然后在100 ml的瓊脂培養基中,加入200 μl的上述溶液、100 μl的IPTG(24 mg/ml)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培養基。當dna片段插入至pUC系列載體(或其他帶有lacZ、Amp基因載體),然后轉化至lacZ缺失細胞中后,涂布上述的X–Gal、IPTG、Amp平板培養基,可根據長出菌體的藍白色,而方便地挑選出基因重組體(白色為具有DNA插入片段的基因重組體)。

        三、注意事項 :

        1、培養噬菌體時,Top agar中的添加量為:50 μl/3 ml(20mg/ml)。

        2、含有X-Gal的培養基4℃避光保存,須在1~2周內使用。

        四、IPTG-X-gal 平板制作

        1、IPTG儲液配置:一般將IPTG配成20%(m/V)(約0.84M)的母液。稱取0.5克 IPTG粉末,用2 ml蒸餾水將其完全溶解后,補加蒸餾水至2.5ml,用孔徑0.22 μm的小型注射型過濾器(預先裝好濾膜滅菌備用)過濾除菌,-20 ℃凍存。

        2、X-gal儲液配置:用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。稱取0.2克X-gal,加入10ml二甲基甲酰胺(DMF),溶解后保存于一小血清瓶內,裝有X-gal溶液的血清瓶須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞,并應貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。

        3、IPTG-X-gal平板制備:在含氨芐或卡那抗生素平板上,滴加40 μL的X-gal儲液及5 μL的IPTG儲液(怕體積過小影響涂布均勻,可適當稀釋后再涂布),涂布均勻后晾干后使用。在臨使用前提前1h制備。

        注:為方便實驗操作,試驗中也可以將X-gal和IPTG的儲備液按照菌液體積和平板數量計算好濃度,直接加入到準備用于涂平板的細菌培養液中,混勻后即可涂平板,這樣可以節省試驗時間。若經過培養后長出的菌落藍白斑顯示的不夠明顯,可以將平板放入4度冰箱里,過一段時間以后菌落的藍白斑就顯示的比較清晰了。

         

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